【PROTAC】新药开发系列（十二）同源选择性降解CDK6

2019年2月21日和25日，哈佛医学院的Nathanael Gray联合Eric Fischer课题组在《CELL CHEM BIOL》和《ANGEW CHEM》上发表了两篇应用PROTACs同源选择性降解CDK6的研究文章。这是第一次报道PROTACs分子实现区分同源蛋白的选择性降解，仅降解CDK6，而非CDK4。

有趣的事：

我们利用分迪科技的蛋白降解小分子新药开发平台（PRODED）在去年7月预测了含CRBN的E3体系如何选择性区分CDK4和6。并在我们的蛋白降解“小讲堂”中提出了E3泛素化标记可以实现比以往抑制剂分子更高的立体选择性，从而有效避免脱靶效应。

1摘要

选择性小分子的设计经常受到配体结合口袋类似性的阻碍。这里，我们报告一种名为BSJ-03-123的PROTAC分子，利用差异三元复合物形成因素，在蛋白质组范围内实现选择性降解细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6），且可区分CDK4。另外，研究工作还论证了降解CDK6对急性髓性白血病细胞的抑制作用，并且从转录组学和磷酸化蛋白质组学分析了快速降解CDK6对协调信号传导和转录的直接影响。

2介绍

细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）协调细胞周期和转录。CDK是丝氨酸/苏氨酸激酶，它们的活性依赖于与细胞周期蛋白的结合，能够对酶功能进行时间控制。CDK4和CDK6通过与D型细胞周期蛋白结合来磷酸化抑制视网膜母细胞瘤基因（Rb）来控制G1-S转换。这减轻了Rb介导的E2F转录因子（TFs）的抑制，从而触发S期所需基因的表达。虽然长期以来认为CDK4和6是赘余的，但最近的研究已经确定了二者的同源特异性功能。特别是，CDK6被认为是连接细胞周期与代谢的调节中枢。某些情况，CDK6的转录作用与其激酶功能无关，而是依赖于分子支架。

CDK4/6的ATP竞争性抑制剂已显示出显著的临床活性，目前已获批了三种CDK4/6抑制剂用于治疗乳腺癌。然而，这些抑制剂都不能区分CDK4和6，因为它们结合的ATP结合口袋的氨基酸序列有94％的序列一致性。此外，目前的抑制剂不能破坏脚手架功能。为了解决这个问题，我们转向基于PROTAC诱导靶蛋白降解的策略。该技术可诱导目标蛋白（POI）被含CRBN的E3连接酶泛素化标记，从而被蛋白酶体降解。有趣的是，多激酶结合抑制剂作为接头的PROTAC并没有降解全部的激酶，只选择性了部分激酶，这表明我们可以选择性地降解目标蛋白。沿着这些方向，研究者证明了利用POI-E3界面中的氨基酸差异从而实现差异性三元复合物形成，可以实现选择性降解目标蛋白。

这里，我们探讨了使用结合两种酶ATP位点的配体设计PROTAC，选择性降解CDK4与6的可行性。我们设计了名为BSJ-03-123（BSJ）的PROTAC分子。试验证明BSJ选择性降解CDK6。将快速降解CDK6与磷酸化蛋白质组学和转录组学分析相结合，我们利用急性髓性白血病（AML）细胞帮助理解BSJ选择性降解CDK6的机制，并绘制了CDK6依赖性信号传导事件的网络图。

3结果

3.1、设计选择性降解CDK6的PROTAC

我们选择帕博西尼作为PROTAC的一端，因为它具有高选择性与活性。CDK6与帕博西尼的晶体复合物（PDB：5L2I?）显示出哌嗪部分暴露在溶剂中，是连接Linker的好位点。我们将其与泊马度胺用聚乙二醇Linker连接起来，得到化合物YKL-06-102（YKL）（图1A）。试验表明YKL与CDK4和CDK6的亲和力有微弱的减少，与重组CRBN-DDB1的亲和力与泊马度胺相当。用YKL进行的细胞处理导致CDK6的选择性降解。我们采用细胞处理后的全局蛋白质组学进一步研究了降解的选择性。实验结果显示，虽然YKL选择性降解CDK6，但也同时降解了IKZF1和3，这可能是由结合CRBN的泊马度胺部分导致的。为了去除YKL对IKZF1和3的降解活性，我们将泊马度胺连接Linker的-NH-改为-O-，但不改变初始Linker长度，命名为BSJ。体外与重组激酶结构域结合的测量（KINOMEScan）证实BSJ有效、快速地选择性降解CDK6。蛋白质组学研究表明BSJ仅降解CDK6而不降解IKZF1和3及其它蛋白。

图1 降解CDK6的PROTAC设计

基于BSJ，我们进一步合成了在体外不能结合CRBN的N-甲基化戊二酰亚胺类似物（BSJ-bump）（图1H）。BSJ-bump不能降解CDK4或CDK6，因此作为BSJ活性的阴性对照（图11）。

3.2、差异三元复合物导致CDK6选择性降解

接下来，我们试图了解CDK6选择性的机制。体外激酶测定证实BSJ对两种激酶均具有一定的亲和力。CDK4/6的类似细胞热稳定性进一步表明，差异细胞靶标参与不会产生选择性（图2A）。因此，我们假设选择性可能源于差异三元复合物的形成。为了在完整细胞中实时监测三元复合物的形成，我们设计了基于NanoBiT技术的荧光素酶互补测定试验（图2B）。我们在表达CRBN的293T细胞中表达了C末端CDK4/6LgBit融合蛋白以及N末端SmBit-CRBN融合蛋白。BSJ连接CDK6和CRBN，诱导快速的剂量依赖性的三元复合物形成，但不与CDK4和CRBN形成三元复合物（图2C）。BSJ-bump不能诱导CDK6与CRBN相互作用（图2C）。另外，通过用泊马度胺或来那度胺预处理来阻断CDK6与CRBN的结合来防止三元复合物的形成（图2D）。因此，我们得出结论，BSJ利用CDK4和CDK6之间的结构差异，通过差异三元复合物的形成实现CDK6的选择性降解。

图2 差异三元复合物的形成导致BSJ选择性降解CDK6

3.3、利用BSJ选择性降解CDK6验证细胞对蛋白的依赖关系

为了论证CDK4不是CDK6富集细胞依赖的重要蛋白，我们转向342个癌细胞系中的基因组规模的CRISPR/Cas9筛选。我们在CDK6依赖模型中鉴定出AML细胞系的显着富集（图3A）。这些细胞系中没有一个显示出对CDK4的依赖性。与基因表达数据的交叉并没有揭示本质性和mRNA转录水平之间的相关性。因此，CRISPR/Cas9介导的AML细胞系MV4-11细胞中CDK4的遗传耗竭揭示了细胞的生长动力学和细胞周期分布，结论支持CDK4在AML细胞系的增殖中可有可无。

图3 利用BSJ验证细胞对蛋白的依赖关系

CDK4/6抑制剂由于缺乏4和6的选择性，无法选择性降解CDK4和6。因此，抑制剂的治疗窗口会受限。我们想测试BSJ是否可以抑制依赖CDK6的AML细胞，但对CDK4依赖性癌细胞系无抑制作用。如所预期的，CDK4/6抑制阻止了CDK4依赖性细胞系的增殖，而选择性降解CDK6不会引发同样的效果（图3B）。相反，在CDK6依赖的AML细胞系中，BSJ通过诱导G1细胞周期停滞没有明显的细胞凋亡作用，但引起了显著的抗增殖作用（图3C-3E）。值得注意的是，这种作用超过给与细胞BSJ-bump的抗增殖效果（图3C）。我们观察到降解CDK6优于抑制CDK6的益处可能是由于其它激酶活性非依赖性分子机制的破坏而致，或者由于降解物的药理学优势，如催化靶转换。为了解决这个问题，我们比较了BSJ和帕博西尼在CDK4缺陷的MV4-11细胞中的作用，作为降解CDK6效果的参考。在该实验中，CDK6的选择性降解不优于酶抑制（图3F）。尽管考虑到分子间的物理化学差异，对这一比较的解释并不简单，但它表明AML细胞对CDK6的依赖性主要取决于其激酶功能。

3.4、CDK6降解后选择性调控网络的损伤

接下来我们研究了药物对已知的CDK4/6RB磷酸化位点S780的影响。实验显示，BSJ和帕博西尼均能降低P-S780水平（图4A）。值得注意的是，BSJ-bump处理未能影响Rb的磷酸化，表明在所测定的浓度下，对CDK4/6的抑制作用不显著（图4A）。仅在剂量递增时观察到BSJ-bump的可测量影响。与此一致，当敲除CRBN后，BSJ处理对Rb磷酸化无影响。

图4 降解CDK6对细胞信号转导的影响

鉴于CDK6的多功能，我们在全局范围内进行了分析，以确定快速和选择性降解CDK6将如何影响AML中的细胞信号转导和基因活性。我们用BSJ与帕博西尼进行了比较。首先，我们将快速给药（2小时，每个200nM）与定量（Ser/Thr）磷酸化蛋白质组学相结合，检测了总共22,804个磷酸肽。先用帕博西尼处理，再用BSJ（44up，153down）和191去调节（57up，134down）磷酸肽，结果显示，药物对这197种去调节的磷酸肽影响不大（图4B）。基于激酶-底物富集分析（图4B），改变的位点富集了CDK基序，验证了短期给药偏向上游事件。磷酸化位点改变的蛋白质富含已知的细胞周期进展调节因子。此外，我们的数据表明，与先前报道的基于体外测定的CDK4/6底物显著重叠，但也发现了未描述的底物，如剪接因子SRRM2和RSF染色质重塑组分RSF1。

同时，我们比较了帕博西尼和BSJ引起的转录反应。这使我们能够确定CDK6是否能够独立于其激酶结构域控制转录。正如预期的那样，由于对IKZF1和IKZF3的脱靶效应，YKL的转录影响与BSJ和帕博西尼显着不同。而CDK4/6抑制和CDK6降解产生非常相似且高度相关的转录反应，我们认为CDK6在AML中的转录作用主要限于其激酶功能。为了进一步探索快速降解CDK6的功能意义，我们对CDK6降解和CDK4/6抑制引起的转录变化进行了基因本体术语分析（图4D）。试验显示，转录结果相似，这表明两者都聚集在已知的途径上，例如细胞周期调节，但也影响DNA复制，DNA损伤反应或染色质组织等过程。

为了获得对CDK6功能的完整理解，我们将转录和磷酸化蛋白质组学分析的数据浓缩，得到了快速降解CDK6后改变的磷酸肽为中心的蛋白质网络（图4E）。基于检测到的磷酸肽中共有CDK磷酸化基序（SP/TP）的存在来划分蛋白质。接下来，我们通过向来自实验衍生网络的成员添加具有已建立的蛋白-蛋白相互作用的ENCODE转录调节剂来扩展该网络。网络扩展仅限于可用的全基因组结合数据。计算CDK6耗尽后的动态转录变化，并将改变的靶基因分配给网络驻留的TF，其基于动态调节的靶基因的百分比在视觉上缩放（图4E）。该集成网络允许识别已知的共识下游信号轴，例如Rb-E2F1，还允许识别之前没有与CDK6相关联的节点，诸如BCL11A和NCOR2。网络拓扑在BSJ和帕博西尼给药之间大部分重叠，再次证明：在AML中CDK6主要通过其激酶功能协调信号传导和基因控制。

4讨论

鉴于底物或辅因子结合位点的结构相似性，高选择性小分子的开发是药物发现中的长期挑战。这也是ATP竞争性激酶抑制剂的关注重点，其中缺乏选择性可能产生严重的毒副作用，从而限制了其治疗窗口。我们设计的BSJ可选择性降解CDK6。因为，BSJ通过与CDK6和E3形成差异三元复合物从而具有在蛋白质组范围的选择性。而且，BSJ的这种选择性超越了CDK4/6抑制剂，可区分CDK4和6。特别地，试验显示BSJ仅对依赖CDK6的AML细胞有作用，因此选择性降解CDK6可以降低总体毒性。BSJ诱导CDK6快速而有效的降解使我们能够绘制库快速降解CDK6对下游信号传导网络和转录程序的全局影响。虽然我们不能排除在饱和浓度下，BSJ也抑制CDK4，但在设定的浓度下没有检测到抑制作用。降解CDK6和抑制CDK4/6的比较分析表明，在AML细胞中，CDK6主要通过其激酶活性协调了信号传导和基因活性。我们的分析还揭示了之前未与CDK6相关的几个信号节点和转录中心，如BCL11A和NCOR2，这对于探索这些途径在AML及其它方面的功能相关性至关重要。CDK6在其它恶性肿瘤以及造血干细胞和白血病干细胞中具有突出的作用。选择性降解CDK6将有助于区分相关的分子机制，并进一步解释激酶依赖性和非依赖性功能。未来的药物化学工作将有必要扩大我们所提出的概念，并开发一个选择性降解剂工具箱，以在前所未有的精度和动力学分辨率下研究蛋白激酶的作用。

5意义

传统上，药物发现工作集中于开发小分子抑制剂，其阻断可接近的疏水口袋，例如底物或辅因子结合位点。然而，由于这些口袋通常具有高序列保守性，选择性抑制剂的设计仍然是一个巨大的挑战。这里，我们报告了一种降解剂，它利用配体结合口袋外的结构差异来诱导差异三元复合物的形成，并仅降解CDK6，而不是CDK4。我们采用这种精确的选择性分子BSJ来剖析AML中CDK6依赖的信号传导和基因表达，试验表明它允许对遗传定义的依赖性进行前所未有的利用。这项工作展示了一种工程选择性小分子探针的框架，并为开发在高动力学分辨率下理解蛋白质功能的工具铺平了道路。

参考文献

doi: 10.1016/j.chembiol.2018.11.006

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